一项日本多中心、回顾性研究发现，过度固定影响HER2 FISH检测结果的准确性，建议胃癌手术切除标本固定时间控制在6-72小时以内。

　　III期ToGA研究证实，曲妥珠单抗联合化疗显著改善HER2阳性晚期胃癌的生存结局，这一方案成为HER2阳性晚期胃癌的一线状态对于患者治疗方案的选择及预后具有重要意义。HER2检测方法主要包括免疫组化（IHC）与荧光原位杂交（FISH），其中IHC用于评估HER2蛋白表达状况，FISH用于确定HER2基因是否扩增。然而，这些检测方法的样本处理条件（包括固定程序）可能存在较大差异，进而影响HER2检测结果。根据2018年更新的ASCO/CAP指南，建议将HER2检测标本采用10%中性缓冲固定6-72小时[2]。乳腺癌相关研究中已发现HER2检测结果与样本固定时间的相关性[3-4]，虽然这些研究结果可能适用于胃癌，但由于HER2过表达特征在乳腺癌与胃癌之间存在差异，因此仍需针对胃癌开展特定研究。近期发布的一项回顾性研究调查了在日本山口县多个中心收集的胃癌标本中是否存在过度固定现象，并通过对手术切除胃癌标本进行IHC和FISH检测，探索了过度固定对HER2检测结果的影响[5]。现撷取重要内容整理如下，以供临床参考。

　　在2011年至2020年的十年间，共计1945例患者被确诊为胃癌。354例患者进行了HER2状态检测，其中，228例不可切除或复发性疾病患者接受了化疗，被纳入总体分析人群中。研究分析了患者的背景、肿瘤特征、HER2检测标本固定时间、曲妥珠单抗联合治疗的应用情况以及生存率。

　　在2015年至2019年期间，从52例接受根治性切除手术的晚期胃癌中获取肿瘤组织标本。每位患者手术切除的肿瘤标本均被均匀分为三个大小相等部分，并立即置于10%溶液中进行固定：其中一个标本固定6-72小时，另一个标本固定1周，第三个标本固定2周。

　　对228例接受化疗的不可切除或复发的胃癌患者进行了HER2检测，以此构成总分析人群。研究结果显示，肿瘤定位、类型、大小或临床分期与HER2状态并无显著相关性。在肠型腺癌患者中，HER2阳性率明显高于弥漫型患者（p0.02）。在141个活检标本中，未发现任何过度固定的病例。然而，在87个手术切除标本中，有9个出现过度固定，占HER2阴性病例的12.5%（9/72）。此外，HER2阳性患者中，83.7%的患者使用了曲妥珠单抗，而在HER2阴性患者中则未使用。综合考虑，3.9%（9/228）的患者标本存在过度固定的情况。然而，HER2阳性和阴性患者在生存率方面无显著差异。

　　52例接受手术的胃癌患者中，36例为男性，16例为女性。中位年龄为77岁。47例患者诊断为T2或T3肿瘤。但在病理检查中，根据TNM（肿瘤、淋巴结、远处转移）分期，6例诊断为T1，7例为T2，13例为T3，26例为T4。根据Lauren分型，24个标本为肠型，而28个为弥漫型。中位肿瘤大小为58.8毫米。

　　在IHC染色后，固定6-72小时组的52个标本有16个（30.8%）得分为0，17个（32.7%）得分为1+，15个（28.8%）得分为2+，4个（7.7%）得分为3+。在固定1周组中，18个标本（34.6%）得分为0，18个（34.6%）得分为1+，12个（23.1%）得分为2+，4个（7.7%）得分为3+。在固定2周组中，15个标本（28.8%）得分为0，23个（44.2%）得分为1+，10个（19.2%）得分为2+，4个（7.7%）得分为3+。在6-72小时组与1周组中有43个（82.7%）标本具有相似的染色分数，在6-72小时组与2周组之间有40个（76.9%，95% CI=63.2%-87.5%）。

　　在固定时间为6-72小时、1周和2周的标本中，HER2检测的IHC染色显示相同的得分（A-D）或随着固定时间延长而减少的得分（E）

　　根据IHC结果，6-72小时组与1周组以及6-72小时组与2周组之间存在正相关（p0.01，p0.01）。然而，在5个标本中（9.6%），经过长时间固定后HER2表达减少（图5E）。固定6-72小时的IHC得分为2+，而固定1周和2周的得分为1+。因此，需要使用FISH技术对这些标本进行重新评估。

　　在6-72小时组的所有标本中确定了HER2/CEP17拷贝数比率，其中7个标本（13.5%）表现出基因扩增（拷贝数比率≥2.0）。然而，在1周组和2周组中，分别有14个（26.9%）和33个标本（63.5%）中无法检测到HER2/CEP17的拷贝数比率。此外，在1周组和2周组中，未检测到（ND）的频率显著高于6-72小时组（p0.0001和p0.0001）。在52个标本中，有38个（73.1%）和19个（36.5%）在6-72小时组与1周组以及6-72小时组与2周组之间呈现相似的HER2/CEP17拷贝数比率。

　　随着固定时间的延长，评估愈发困难的样本数量增加，原因在于信号减弱（图5A）或背景噪音增强（图5B）。 FISH检测结果显示，15个IHC得分为2+的样本中，有5个（占33.3%）因过度固定而误判。 这一发现对临床实践具有重要意义。

　　（A）固定时间为6-72小时（比率5）和1周（比率2.62）的标本中观察到高度放大的信号（红色斑点）。然而，在固定2周后，由于放大效果减弱，信号无法检测到。（B）在固定时间为6-72小时（比率1.05）或1周（比率0.95）的标本中观察到低度放大的信号（红色斑点）。由于细胞结构破坏，固定2周后信号无法检测到。

　　本研究旨在探讨临床标本固定频率在胃癌患者HER2状态评估的应用，并使用石蜡包埋的手术切除标本，分析固定时间对HER2检测IHC和FISH结果的影响。研究结果证实，在临床实践中，用于HER2状态测试的标本有时会出现过度固定情况。在所有临床评估HER2状态的胃癌标本中，3.9%存在过度固定，在72个HER2阴性且手术切除的标本中，12.5%存在过度固定。尽管应严格控制标本的处理，但在真实临床环境中，仍可能使用固定时间超过推荐时间的标本来确定HER2状态。此外，在这项研究中，52例晚期胃癌切除标本的IHC染色结果显示，在6-72小时组与1周组之间，以及6-72小时组与2周组之间，分别有82.7%和76.9%的病例呈现出类似的染色评分甲醛处理。而在FISH检测中，仅有73.1%和36.5%的标本在6-72小时组与1周组，以及6-72小时组与2周组之间显示出类似的基因扩增状态。

　　异质性指肿瘤内基因型或基因表达的差异。在胃癌中，使用IHC或FISH检测到零星阳性结果时，就会使用该术语。理想情况下，应该使用相同的HER2阳性肿瘤组织块进行IHC和FISH分析，以确定HER2强度最大的区域，而不考虑组织学类型或分级。在与溃疡部位相邻的肠上皮化生区域或高度异型增生区域，可能观察到假阳性反应，因此应该避免使用这些区域的标本。还应避免压痕伪影和坏死组织。IHC强度较大的区域还可能存在基因扩增[1]。因此，本研究中为了分析固定时间对HER2 IHC和FISH的影响，将每位患者的术后肿瘤标本均分为三等份，分别使用固定不同时间。以分析固定时间对HER2 IHC和FISH检测的影响。

　　根据IHC染色，即使固定时间较长（1和2周），三组之间的HER2表达几乎相同。在6-72小时固定后使用IHC评估为HER2过表达（得分3+）的标本，即使在固定1或2周后，仍保留HER2高表达状态（得分3+）。NCCN指南建议，对于IHC评分为2+的标本，应进一步进行FISH评估[6]。因此，为准确诊断胃癌，需选用适宜标本对HER2检测中的IHC和FISH结果进行精确评估。在6-72小时组中，15例患者HER2得分为2+，其中5例在1或2周的固定后HER2得分为1+。这些患者可考虑给予HER2靶向治疗，取决于FISH结果。然而，若依据长时间储存样本的IHC结果，可能无需进行FISH检测。

　　本研究证实，固定时间对FISH结果具有显著影响。在固定1周的样本中，无法确定HER2扩增状态的比例为26.9%，而在固定2周的样本中，这一比例上升至63.5%。这种不确定性可能源于以下几个方面：FISH作为一种分子细胞遗传学方法，其原理是将特定的DNA序列与靶基因组进行杂交。固定过程会导致细胞结构的复杂性增加以及染色质的浓缩，进而引发DNA断裂和化学修饰导致的交联。因此，探针与靶DNA的穿透和相互作用可能面临一定困难。这些化学修饰可能是导致扩增减弱和细胞结构破坏的主要原因[7]。

　　总之，本研究结果显示，固定时间对胃癌HER2检测的IHC和FISH结果具有一定影响，与此前的乳腺癌研究结果相似。因此，参照ASCO/CAP指南中对乳腺癌检测样本的规定，建议胃癌样本固定时间控制在6-72小时以内，以确保最大限度降低假阴性结果的风险，从而为患者提供更为精准的诊疗方案。